NKT_Onefive激光器应用案例：STED受激发射损耗荧光显微镜

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受激发射损耗荧光显微镜(STED)

荧光显微镜能够以微结构对细胞区室进行高度特异性成像，同时获得最高对比度。然而，由于衍射极限的存在，常规显微镜的分辨率被限制在半波长左右。为突破分辨率限制，在过去的几十年间产生了多种不同的方法，如通过不断开启和关闭单个荧光光斑、结构化照明、光学波动或用损耗光减小光斑发光面积等。

而STED技术是其中最为有效的光学超分辨方法之一。通过引入一束损耗光以受激发射的方式来抑制有效荧光的发射，STED可以实现超衍射极限的分辨率。自1994年Stefan W. Hell提出以来，STED技术已日趋成熟。

工作原理：

STED受激发射损耗显微镜技术广泛应用于生物、医学和材料领域，以突破衍射极限、实现高分辨的荧光样品显微。在共聚焦扫描显微镜中，样品被一束衍射极限的脉冲激光激发，伴随的圈状二级光束则是发色团发光时产生的红移。

左：来自SUPERK的衍射极限激发光；中：来自Katana-HP的圈状损耗光；

右：损耗后的超分辨率荧光信号。 

这就能够使得共聚焦激发光团的外圈被耗散，而剩下的荧光就仅会从激发光团的中心收缩处发射。

荧光信号的时间表现。上：圈状光斑中央的最小值； 下：圈状光斑带损耗光后。

SUPERK超连续谱激光器能够提供可见光(VIS)及近红外(NIR)范围内的连续光谱、优秀的单模光束质量(M2<1.1)和皮秒(ps)级别的脉宽。与NKT Photonics的滤光片技术结合后，就可以转变为可调谐激光器，从而优化可将光和近红外区域内的每种光团的吸收激发。

SUPERK激光器经SUPERK SELECT后，在多个不同滤光范围内的超连续谱激光透过率

Onefive KATANA HP高功率皮秒激光器也适用于可见光-近红外范围内的不同波长，能够提供皮秒级别脉宽的激光脉冲，因此适用于作为STED的损耗光。

蓝色：SUPERK Extreme EXW-12的光谱功率密度；红色：KATANA HP激光器的可用波长

除了使用适当的波长和激光功率组合外，在STED显微镜中，精确调节激发光和损耗光脉冲的同步也至关重要，从而实现在每个荧光周期开始时同步激发光团的有效耗尽。

NKT Photonics的锁模超连续谱激光器配备有NIM触发输出，内置可调触发延迟的标准功能。Onefive KATANA HP皮秒激光器可以作为外部触发输入的从属激光器，从而允许通过软件精准、简便的调整激励和耗尽脉冲。

激发光和损耗光脉冲易于调制，可便捷地优化损耗光以获得最佳分辨率

在实验中，分辨率主要受所用发色团的光物理限制，这也是荧光显微发展迅速的原因。因此，超连续谱激光器自由选择激发波长的灵活性有助于为Vis-NIR波段荧光显微未来的发展做好准备。

SuperK平台与KATANA HP激光器系列产品的结合，是市场上STED荧光显微产品的最佳交钥匙解决方案之一，已经通过全球多个案例的成功验证。其中最为知名的就是在德国徕卡显微系统公司(Leica)的SP8 X共聚焦显微镜中的应用，自2014年10月起Onefive已正式成为其脉冲受激发射损耗系统(STED)中775nm专用激光源的独家供应商。

共聚焦扫描显微镜图像（左）与超分辨率STED图像（右）的对比。来源于Leica TCS SP8 STED 3X显微镜(Courtesy of Leica Microsystems)。

 

适用于STED显微镜的硬件配置：

 

超连续谱激发光：

SuperK FIANIUM/ EXTREME

SuperK SELECT/VARIA

SuperK 保偏光纤传输

 

脉冲损耗光：

Onefive KATANA 08 HP(775 nm)

Onefive KATANA 06 HP(592 nm)