Qioptiq 光源推动PCR技术研发

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浅谈数字PCR

引言

近来，新冠肺炎的疫情牵动着人们的心，在医疗工作中快速、准确的确诊感染者和判断患者康复情况至关重要。社会大众对于新冠病毒PCR核酸检测的准确性、有效性也颇为关心，那么到底什么是PCR核酸检测呢？

PCR技术（聚合酶链式反应技术, polymerase chain reaction），是通过模拟体内的DNA复制方式，在体外有选择性地将特定基因（或DNA序列）扩增，使得样本中原本数量极少的特定基因数量变得足够庞大，从而能够被光学法或其他体外诊断方法检测出来。

PCR反应过程主要为三步：变性、退火和延伸。变性是通过加热使DNA双链打开形成单链。然后退火降温，温度降低后加入的引物会与DNA中互补区相结合。最后的延伸过程，在DNA聚合酶作用下，聚合酶催化引物延伸，合成出于DNA新链。以上的三个步骤为一个循环，通过不断的循环半保留复制，一个DNA分子就会被复制成无数个同样的DNA分子。

图1 PCR反应过程

以上步骤完成了特定基因的扩增，后续就是对扩增基因的检测。目前最为主流的检测方法是荧光光学法，荧光PCR (qPCR)是第二代PCR技术，就是在PCR反应过程中加入荧光基团，通过直接测量激发后的荧光光信号强弱，从而实时、定量地检测样本中的特定基因。

荧光PCR因其简便、安全、非接触式的优点，得到了非常广泛的应用。然而荧光PCR也有自己的缺陷，其依赖标准曲线和参考样本、难以精确测定基因拷贝数、精确度也有不足的问题。这也是此次新冠疫情中，一些专家建议在核酸检测的同时，参考胸片CT影像综合诊断的原因。针对这些情况，能够绝对定量的第三代PCR技术——微滴式数字PCR技术(Droplet Digital PCR, DDPCR)显然具有更广阔的应用前景。

图2 qPCR典型原理图

 

什么是微滴式数字PCR？

 

微滴式数字PCR是一种基于PCR反应的单分子绝对定量技术。原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配为数以万计的微液滴，尽可能使得每个反应中含有一个模板，然后进行单分子模板的PCR反应。这样含有模板的液滴在扩增后就会具有较强的荧光，依次测量每一个微液滴读取荧光信号，再针对荧光信号的有无计数就可以实现绝对定量。

图3 微滴式数字PCR反应过程

dPCR通过对样本的微滴化处理，大大提升了测量的灵敏度和准确性，只需要非常少的模板量就能够进行检测。此外，dPCR还弥补了qPCR系统需要严格依赖标准曲线的问题，测量绝对定量，对逐个微液滴的统计分析结果可靠。在实际应用中，dPCR还具备防污染和全集成的优点。PCR反应被严格局限于水相微液滴中，能够有效避免接触污染，也易于集成和自动化。

数字PCR的检测灵敏度较荧光定量PCR高1-2个数量级，更适合检测微量痕量病毒，此次冠状病毒感染也出现了早期症状不明显、但核酸检测呈阳性的的“潜在感染者”和“隐藏患者”。

借用一个例子，qPCR检测突变像是在大海里捞一个会发光的针，周围都是海水，很难看到针的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多个碗里面，瞧一眼很容易就知道哪个碗在发光了，而且，系统还会数出来到底有多少个碗里是发光的，多少个碗里是没发光的，这样一比，就很容易的知道有多少数量的突变，就能做到绝对定量了。

一句话概括：微滴式数字PCR：“数(shǔ)数(shù)”

 

微滴式数字PCR的荧光检测方法

 

dDPCR的荧光检测主流方法主要有两种，一种是以QuantStudio™ 3D数字PCR系统为代表的微流控芯片加工法，另一种则是以Bio-rad QX200为代表的微滴法。这两个产品也是目前国内三级医院所使用的数字PCR主流产品。

QuantStudio™ 3D数字PCR系统基于高密度的微流控芯片，将样品均匀分布到多达20000个微孔中相互隔离。PCR反应后，通过高亮度LED光源激发荧光信号，使用冷CCD进行检测，再读取每个微孔的信号进行计数。

图4 基于微流控芯片技术的数字PCR

Bio-rad QX200则是借助了微滴技术和微流体技术，借助微滴发生器生成20000个均一的微滴，经PCR反应后再将液滴吸入管路依次通过一个双色光学检测系统，再检测阳性和阴性的微滴数量。

 

图5 微滴式数字PCR典型检测光路

图5为一种典型的流式装置光路布局：布置在侧面的激发光源产生的激发光，经二色镜反射并聚焦到微液滴流道上，微液滴在流道中依次排列一个个地通过聚焦位置，每个微液滴依次被照射产生激发荧光。荧光在被布置在下方的探测器收集，经过光电器件转变为易于处理和分析的电信号。

QuantStudio™ 3D之流的荧光成像法有几个优点。

首先，可以高通量地检测到带有荧光信号的液滴，在一张图像中可以同时检测到数千个液滴。通过独特的广角镜头，甚至可以同时检测到100万个液滴。

其次，光学系统的设计相对简单明了，甚至传统的数码单反相机都可以用来进行荧光成像。

第三，通过在多路检测中添加多个荧光滤光片，可以方便地实现多色荧光成像。

然而，由于光源的稳定性变化和相邻液滴间的荧光信号干扰，使得荧光成像的检测灵敏度和动态范围受到限制。

Bio-rad采用的激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)细胞计数法，在LIF中，液滴经过流式光路检测，以每秒数百至数千液滴的速度检测荧光信号。并且LIF检测可以加上光学共焦检测模块，入射激光和发出的荧光信号分别通过针孔，通过抑制非焦平面的光学噪声来提高信噪比。

LIF流式检测可以获得更高的灵敏度和动态范围。然而，与荧光成像系统相比，LIF光学系统的设计相对复杂。不过对于临床应用来说，高灵敏度的荧光检测对于ddPCR获得可靠、准确的患者标本诊断结果至关重要。

 

微滴式数字PCR的激发光源选型

实际应用中，因为微液滴尺寸非常小，单个微液滴的直径仅约几十微米，且在流道内高速流动，往往单个液滴接收到激发光照射的时间不到1微秒。这就要求激发光源发出的激发光必须在很短的时间内，使得聚焦位置达到足够的光照强度，因此激发光必须同时具备光强度高、稳定性好的特点，因此最好采用高稳定激光器作为激发光光源。

此外，因为微液滴大小的限制，激光器本身的指向稳定性、功率稳定性和噪声也有要求。

 

流式光路设计

来自英国的Qioptiq公司（EXCELITAS集团）是一家提供高端光子解决方案的供应商，有着齐全的光源、光学/电子学和探测器等产品线和很强的OEM能力，可以从零开始在短时间内设计和定制流式细胞仪等复杂光学仪器光路解决方案。对于PCR系统中流式光路部分，可以为定制者提供灵活可用的方案。这是一个省心并高效的选择，在生命科学分析仪器中，可以兼顾厂商往往极为关心稳定性和实效性。

图6  四通道流式原型机，从草图到原型机仅用时8周。所有主要产品均来自EXCELITAS

（组件：1、两台配有光纤的Qioptiq iFLEX-iRIS™固态激光器；2、六个Excelitas LynX™ SIPM探测模块3、Qioptiq kineMATIX™光纤耦合器4、Qioptiq OPTEM显微物镜5、LINOS Microbench和轨道系统）

采用的的iFLEX系列激光器是一系列低噪声、高稳定的激光器，具备功率高度稳定、光束指向稳定性优异、超低噪声，非常适合作为微滴式数字PCR系统的激发光源。直接搭配合束及整形输出，可以将光路最简化，以便尽量消除流式光路中各种潜在的光噪声干扰。迷你的光纤激光模块拥有即插即拔的KineFLEX专利技术，可以确保极端的稳定性。

图7 定制的流式光路产品：双波长激光器光纤合束整形输出所需光斑（约20*80μm）

 

“将高可靠性的激光源集成到OEM系统中，从而实现极致精度和照明性能。”

无限插拔的合束/分束/耦合光纤系统，可以让光路更简化、稳固、便捷设计。